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微生物食用胶——结冷胶的研讨新进展
发布时间:2022-09-25 17:59:00 来源:华体会官方登录网站

  【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研讨所,福建福州 350003;福建省农 业科学院农业生物资源研讨所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源 研讨所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研讨所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研讨所,福建福州 350003

  微生物胞外多糖 (exopolysaccharides,EPS)是微生物在成长代谢进程中排泄 到细胞的胞外多糖。现在已工业化出产的微生物胞外多糖有葡聚糖及其衍生物、黄 原胶、结凝胶、凝乳胶、茁霉多糖、鼠李胶、沃伦胶以及通明质酸等[1],已广 泛运用于农业、食物工业、日化工业、石油工业、制药以及生物工程范畴[2]。 结冷胶 (Gellan Gum)是美国 Kelco 公司 20 世纪 80 时代开发的一种微生物食 用胶,它是由伊乐假单胞菌 (Pseudomonas elodea)在中性条件下,以葡萄糖 为碳源、硝酸铵为氮源及一些无机盐所组成的培育基中,经有氧发酵而发生的细胞 胞外多糖胶质,是一种新式的全通明的凝胶剂。结冷胶是一种线 年得到美国 FDA 的答应并开端运用 于食物饮料中,欧共体在 1994 年将结冷胶正式列入是食物安全代码 (E-418)表, 我国也在 1996 年批准其作为食物增稠剂、安稳剂运用 (GB2760-1996)[4]。 2005 年之前,我国的结冷胶商场简直彻底被美国凯可公司独占。2005 年之后, 我国才有科研院校开端研讨结冷胶的发酵和出产技能,最早开端展开结冷胶研讨的 为无锡轻工业大学 (现江南大学),也呈现国内的结冷胶出产厂家如浙江中肯、 浙江天伟与河北鑫合等企业。现在,国产结冷胶在我国商场上占的份额越来越大, 可是我国结冷胶的商场需求量增加很快,且国内结冷胶的出产规模小,能耗本钱高。 美国凯可公司能够出产较多标准的结冷胶,国内厂家能出产的结冷胶的标准较少, 高酰结冷胶基本上国内不能出产,且国内出产厂家在出产进程中存在能耗高、产品 提取冗杂、产品弄清困难、产品纯化困难等难题。因而,加大对结冷胶的根底和应 用方面的研讨是现在我国国内结冷胶职业快速开展的重要保障,怎么使大专院校、 科研单位和结冷胶出产厂家成为结冷胶技能研讨和推行的主体,是国内结冷胶职业

  亟需处理的问题。本文首要从结冷胶的结构组成,理化特性,生物组成途径,发酵 出产和提取及其在食物等职业运用等方面介绍结冷胶的研讨进展,为结冷胶的研讨 奠定理论根底。 结冷胶的单糖组成是葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸,其组成份额大约为 2∶1∶1, 分子量约为 0.5×106 道尔顿[5]。它的主链是一个线-衔接的葡萄糖醛酸单位和 1,4-衔接的鼠李糖 单位组成[6]。其间结冷胶有 2 种存在办法:天然结冷胶也称高酰基结冷胶 (图 1-a)和低酰基结冷胶 (图 1-b)。天然结冷胶在第 1 个葡萄糖基的 C3 方位上有 1 个甘油酯基,而在另一半的同一葡萄糖基的 C6 的方位上有 1 个乙酰基键,因而 它构成的凝胶柔软,赋有弹性并且粘着力强,与黄原胶和刺槐豆胶的功用类似。低 酰基结冷胶是天然结冷胶在 pH=10 或更高情况下加热处理取得的产品,其分子 结构的酰基悉数或部分被去除,使得分子间空间阻止效果显着削弱,构成的凝胶能 力增强,具有强度大,易脆裂的特色,与卡拉胶,琼脂的凝胶特性类似。 结冷胶产品呈米黄色,无特别的味道和气味,在 150℃时直接分化。结冷胶具有 杰出的安稳性,耐酸、耐高温、热可逆性,还能反抗微生物及酶的效果[7]。结 冷胶不溶于非极性有机溶剂,也不溶于冷水,但如略加拌和即可溶解于水中,加热 即溶解成通明的溶液,冷却后,则构成通明且坚实的凝胶。结冷胶溶于热的无离子 水或整合剂存在的低强度离子溶液,结冷胶的水溶液呈中性。结冷胶在阳离子存在 时,在加热后冷却生成坚固脆性凝胶。结冷胶的硬度与浓度成正比,并且在较低的 二价阳离子浓度时会发生最大凝胶硬度。结冷胶具有明显的温度滞后性,胶凝温度 远低于凝胶的消融温度,凝胶的凝聚温度在 30~45℃,而凝胶的熔化温度高于 100℃,这首要取决于阳离子类型和浓度等条件。结冷胶的成胶浓度低,一般为 0.4~0.5 g·L-1 时即能构成凝胶,当参加二价阳离子时,浓度则更低[7]。 结冷胶多糖是在细胞内组成的,然后经过载体脂蛋白效果穿过细胞壁获细胞膜而分

  泌到细胞外。结冷胶的生物组成途径,现在还没有构成完好的理论, S.paucimobilis(ATCC31461)组成结冷胶的系统或许包含 5 个因子,即:糖基 -核苷酸、酰基供体、脂中间体、酶系统及糖基受体,供给糖基-核苷酸的活性前 体被假定为 UDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖和 UDP-葡萄糖醛酸,作为重复四糖单 位组成结冷胶的单体供体图 2[8]。 少动假单胞菌代谢葡萄糖有 2 种办法:Enter-Doudoroff 途径或 PentosePhosphate 途 径[9]。现在以为结冷胶生物组成在 3 个水平上存在着调控-糖 激活前体的组成、重复单位的拼装和结冷胶的聚合与排泄。在组成途径中,PgmG 是结冷胶组成的要害酶,因为它呈现在糖代谢的分支点上,是代谢工程的抱负靶位 点,G6P 进入异化进程发生能量和耗费能量,而 G1P 是结冷胶和其他细胞聚合多 糖组成所需糖核苷酸的前体。有报导结冷胶的产值和功用特性与结冷胶分子链长、 酰基含量等有关,依据猜测 gel 簇的 gelC 和 gelE 基因与结冷胶链长的调理有关; gelB、gelK、gelL、gelQ 基因与四碳重复单元的拼装有关;cesl0 基因编码的蛋 白质与乙酸和甘油酸的衔接有关。Rocha 等人发现葡萄糖二磷酸尿核苷脱氢酶在 结冷胶生物组成中起至关重要的效果[28]。 结冷胶的出产菌能在以葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖等作为碳源,硝酸铵、酵母膏、 蛋白胨等为氮源及其他微量元素的培育基中成长并产胶,发酵培育温度一般在 27~30℃。结冷胶的发酵出产中,培育基成分 (如碳源、氮源等)和发酵条件 (如种龄、接种量、温度等)对其分子质量散布、溶液的流变学特性等有明显的影 响;别的,生物反响器的形状和结构对结冷胶的动力学及流变学特性也会发生很大 的影响。 现在美国 Kelco 公司结冷胶的出产菌株为伊乐假单胞 (ATCC 31461),经过系 统分类判定为少动假单胞 (Pseudomonas paucinobilis),终究命名为少动鞘 脂单胞菌 (Sphingomonas paucimobilis)。菌株为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,

  巨细 1.4μm×0.7μm 左右,室温 (25℃)液体培育系有鞭毛和动力,37℃培育无 鞭毛和动力,胞内有聚 β-盐,氧化酶阳性,过氧化酶阳性,精氨酸双水解 酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阴性。不能复原硝酸盐,能水解 ONPG、七叶 灵、吐温 80,42℃不能成长[1]。 结冷胶的出产菌——伊乐假单胞(ATCC31461)是从植物体中别离出来的。 Pollock 指出少动假单胞菌能够从土壤、植物体 (莴苣,生菜致病菌)、医院临 床标本和水样中得到[30]。Adkins 研讨的产胞外多糖的少动鞘脂单胞菌来自土 壤[31]。陈光远等从前从小儿败血症肺炎患者血液中别离出少动假单胞菌[3]。 工业出产上,常常经过诱变育种挑选出高产或许功用性菌株,以进步结冷胶的产值 和质量。West 等别离出了 S.paucimobilis 一个抗氨苄的骤变株,经过与原菌株 比较,出产结冷胶的水平要比原菌株高大约 1.4 倍以上[9]。Wu 等发现在低温 条件下 S.elodea 的 VHb 基因的接连表达能明显进步菌株胞外多糖的产值[29]。 少动假单胞菌株能在多种碳源条件下成长。Fialho 等比较了葡萄糖、乳糖和新鲜 的干酪乳清等碳源对 S.paucimobilis 发酵出产结冷胶的影响,发现最佳的碳源为 葡萄糖[10]。彭志英和张红城得到以葡萄糖或蔗糖为碳源,发酵液中生物量较 多,菌体成长较好,蔗糖浓度为 30g·L-1,葡萄糖浓度为 20~40g·L-1 时,菌 体成长最好,生物量最高,乳糖一般,淀粉产的生物量很少,简直没有增量 [11]。彭志英等发现碳源的增加办法对结冷胶的产胶率影响很大,二步加糖法 可使发酵液的黏度显着进步,产胶率也大大进步[11]。KanariBanik 和 Upadhyay 发现少动假单胞菌株最易运用的碳源为 3%葡萄糖、4%蔗糖、3%可溶 性淀粉,但葡萄糖的浓度不能大于 3%,否则会按捺结冷胶的组成,若葡萄糖分 2 次增加时,产值由本来的 6.00 g·L-1 进步到 8.12g·L-1[12]。Nampoothiri 等人对出产结冷胶的碳源研讨得到,该菌最佳碳源为 2%可溶性淀粉,其结冷胶的 产值能够到达 24.32 g·L-1[13]。

  结冷胶发酵出产常用的氮源为硝酸铵,而 WestStrohfus 和 Santiago 以为用大豆 油胨、玉米浆或玉米粉、蛋白胨等有机氮源替代培育基中的硝酸铵,都能使结冷胶 的产值进步[14]。Nampoothiri 等研讨了酵母膏、蛋白胨和各种无机氮源对结 冷胶出产的影响,发现最佳氮源为蛋白胨,其产值为 32.10g·L-1,一起还发现添 加 0.5%苏氦酸能进步结冷胶产值[13]。 少动假单胞菌成长延后为 0~4h,对数成长期为 4~12h,平衡期为 12~24h,结 冷胶发酵进程中菌株的种龄和接种量巨细直接决议发酵进程菌株成长繁衍速度 [12]。李水兵等经过试验得到少动假单胞菌成长曲线h, 最佳接种时刻约为 15~20h[15]。Nampoothiri 等发现 S.paucimobilis ATCC 31461 的最适种龄和接种量分别为 20h 和 10%[13]。 跟着 pH 值的增高,发酵液的生物量也随之增加,pH=7.2 时,生物量最多;pH =6.5 时,产胶量最高;pH=8.0 时,菌体简直不成长,也不产胶。West 研讨发 现结冷胶发酵的最佳 pH 值为 6.8~7.4[9]。 无机盐类型在少动假单胞菌株发酵进程中,对发酵液的粘度有重要影响。Ca2+对 结冷胶的粘度影响最明显,跟着参加量的增大,发酵液的黏度也随之增高,最高可 达 12 000mPa·s-1,但产胶量并未显着增加[11]。结冷胶凝胶 (质量分数为 0.05%~0.25%)的凝胶强度随胶质量分数的增大而增大,随 Ca2+质量分数的增 大呈先增大后减小的改动规则,Ca2+的最适用量为 200~280 mg·kg-1[33]。 彭志英等[11]发现浓度为 0.5g·L-1 的 KH2PO4 产胶量较多,发酵黏度也大; 0.1g·L-1 MgSO4 或 0.3g·L-1 MnSO4 的产胶率最高。 Banik 等研讨发现,与其他金属盐类比较,运用低剂量的 K2HPO4 能够进步结冷 胶的产值,可是磷酸氢二钠和氯化镁的影响更大些,在 0.05~0.1 g·L-1 的规模 内,结冷胶的产值跟着它们用量的增加而增加[16]。 结冷胶发酵液属高粘度反响系统 (最高达 7 000~8 000cP)。在结冷胶发酵进程

  中进步传质和传氧是决议结冷胶产值的要害因子。因为在种子罐中培育的种子液除 确保被运用的培育基外,满足的通气量也能够进步种子液的质量。彭志英等发现溶 氧传质系数为 50L·h-1 和 100L·h-1 时,菌体成长较好,发酵黏度分别为 37 500mPa·s-1 和 45 000mPa·s-1,产胶量分别为 8.76g·L-1 和 8.98g·L-1,表 明高溶氧对 S.paucimobilis 的成长和产胶有利[11]。在溶氧量 (DOT)为 100% 时,转速为 500r·min-1 时,结冷胶的产值从本来的 15g·L-1 增加到 13g·L-1 [34]。 别的,现在传统的机械拌和发酵罐是针对低粘度发酵系统规划的,运用于高粘度体 系时有主体混合差、传质功率低而能量耗费高级缺陷,使反响系统的养料和氧气供 应成为进步发酵功率的约束要素。MT 轴向流拌和桨尤其是混流浆的拌和型氏适用 于高粘度发酵,能够使结冷胶发酵出产强度进步 20%左右,发酵液粘度进步 1.1 倍[31]。 表面活性剂可影响脂类代谢,进步细胞膜的通透性,对发酵也有影响。彭志英等得 出增加 0.02 g·L-1 土温时的发酵产胶量效果最好[11]。我国张禹等创造的微生 物多糖结冷胶的制备办法中也以为在发酵液中参加表面活性剂吐温 60 有利于发酵 液的产胶[35]。 结冷胶的产胶率与培育基的组分有密切关系,现在经过改动培育基的组分来进步结 冷胶的产值。Banik 等优化了断冷胶的发酵配方,以为结冷胶的最佳的发酵配方为 糖浆 2.5g,蛋白胨 1g,casa minoacid 1g,磷酸氢二钠 1g,二氯化锰 0.947g, 此刻结冷胶的产值能够到达 13.814g·L-1[16]。彭志英和张红城经过二步发酵 法得到结冷胶的发酵配方:第一阶段,培育基成分为蔗糖 10g、NH4NO3 0.5g、 KH2PO40.5g、MnSO40.3g、MgSO40.1 g,吐温 80 0.02g 溶于蒸馏水并定容 至 1 000mL,pH7.2±0.01,温度 33~35℃,高溶氧;第二阶段,发酵 10~12h 后,补加蔗糖 40g·L-1,温度 24~25℃,pH 6.5±0.1,高溶氧[11]。

  结冷胶的出产是高粘性代谢产品的微生物发酵进程,胞外多糖环绕细胞以粘多糖形 式构成网状结构,因而难以将多糖与细胞别离。现在提取多糖的一般办法是将发酵 液稀释若干倍,然后经过离心菌种和多糖,选用醇沉积办法来提取多糖。我国现在 张禹等创造的高酰基结冷胶提取办法是经过将发酵液 pH 值调至 4~4.5,升温到 (90±2)℃,并保持 10~30min,灭酶杀死菌体,随后参加占发酵液体积 2~3% 的电解质溶液,反响 30~40min,然后参加异丙醇固液别离,并进行线]。尹洪波等创造了低酰基通明结冷胶的提取办法,首要包含结冷胶发酵液 的碱处理、对碱处理后的液体进行粗滤和微滤和对微滤得到的结冷胶进行压力式喷 雾枯燥[37]。 1988 年,日本成功地完结了断冷胶的毒理试验并允许结冷胶在食物中运用。 DHAR S 等经过调查老鼠胚胎纤维细胞和人类神经胶质瘤细胞的纳米金吸收量和 毒性测验,28d 后老鼠血液生化目标未呈现任何反常[24]。因而,结冷胶作为 一种新式无毒的微生物胞外多糖,其用处十分广泛,在食物范畴首要用做增稠剂 [18-20],凝聚剂、悬浮剂和成膜剂等,作为一种新式的食物增加剂与其他同 类产品比较具有用量少、功用更安稳、凝聚度高、凝胶清亮及品尝功用优越,是继 卡拉胶、琼脂和黄原胶之后的最抱负的增加剂。 结冷胶除在食物上运用外,还可运用于其他许多工业,如在医药上可用作眼药水, 软硬胶囊,包衣剂及新式制剂用药水;结冷胶在环孢菌素的出产中可用于固定载体 [29]。研讨发现结冷胶纳米金和抗肿瘤活性槐糖脂的轭合物能有效地杀死人类 神经胶质瘤及干细胞[25]。浓度为 0.3%的结冷胶作为扑热息痛药物的增溶剂, 临床试验证明 30min 内就能够对扑热息痛有缓解效果[26]。结冷胶在软骨安排 工程学中能够作为一种可打针的血管打针剂[27]。在化工上可用来做涂膜、胶 黏剂、牙膏、在农业上可用作叶肥、缓释肥料、它还能够作为琼脂的替代品制备生 物培育基[5]。结冷胶在其他方面的运用也很广,包含作为人体安排资料、感光

  薄膜、房间幽香剂、包裹热灵敏资料 (例如酶与细胞、脱氧核糖核酸电泳与别离 的可逆凝胶)以及用于胶片、胶卷、纤维、个人护理用品[21]。结冷胶具有可 再生性,易被润饰和在可操控条件下出产的改进特性,在食物、制药、石油等工业 中具有广泛的用处[22]。 结冷胶是一种杂乱的新式亲水性胶体,具有冷、热条件下构成热可逆凝胶及结构和 性质的多样性,在食物、医药和生物制药工业,电泳等方面具有重要效果。可是目 前我国国内结冷胶大规模工业化出产存在发酵产率低,发酵进程中通气拌和能耗高, 产值提取冗杂,产品弄清困难等,直接导致其出产本钱高,损害了企业结冷胶出产 的积极性。并且结冷胶在我国的销价格格仍然偏高,现在国内结冷胶价格在 200~300 元·kg-1,美国 Kelco 公司出产的结冷胶在我国的推行价格高达 450~ 500 元·kg-1;一起与美国斯比·凯可公司具有的结冷胶的标准比较,国内厂家的 结冷胶标准型号比较少。因为结冷胶运用比较杂乱,在运用进程中需求考虑到外加 离子的种类和浓度、螯合剂、食物系统的 pH 规模、增加糖类的种类和规模等,因 此只要在充沛了解结冷胶功用的根底上才干正确运用结冷胶产品。 因而怎么使高级院校、科研单位和结冷胶出产厂家成为结冷胶技能研讨和推行的主 体,也是国内结冷胶职业亟需处理的问题。一起加大对结冷胶根底及运用研讨的力 度是结冷胶职业开展的要害。如从生物技能的视点,经过物理、化学诱变、细胞融 合、基因克隆、PCR 等技能诱变得到高产菌株;将产胶基因转移到嫌气性微生物 中正常表达,从而在无氧或微氧条件下出产以降低本钱,进步结冷胶的产值。

  [1]李苏龙,张红城.少动鞘脂单胞菌菌种挑选与判定的研讨[J].查验检疫科学,2000,10:12 -15. [2]胡国华.新式食物胶在我国的开发运用现状及远景 [J].中国食物增加剂,2005,(S):33



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